Техники забора сперматозоидов при азооспермии

Сперматозоиды для инъекции в яйцеклетку при азооспермии могут быть получены при помощи открытой биопсии яичка с последующей экстракцией сперматозоидов (ТЕSЕ) или аспирации содержимого придатка яичка (МЕSА), а также при помощи чрескожных аспирационных оперативных вмешательств на придатке яичка (РЕSА) или яичке (ТЕSА).
Операцию обычно выполняют в день пункции фолликулов и забора ооцитов у женщины. Однако известно, что сперматозоиды, полученные из придатка яичка, сохраняют способность к оплодотворению в течение 12-24 часов, а тестикулярные сперматозоиды в течение 48-72 часов, что позволяет в некоторых случаях варьировать время проведения обеих процедур.
Также возможно использование криоконсервированной ткани и аспирата яичка и/или эпидидимуса по письменному заявлению пациентов - в этом случае процедуру забора сперматозоидов проводят заранее, независимо от пункции фолликулов яичника жены.
Выбор оптимального способа получения сперматозоидов осуществляется врачом - андрологом после дополнительного обследования.

Показаниями к хирургическому получению сперматозоидов являются:
•    обструктивная азооспермия
•    первичная тестикулярная недостаточность

Противопоказанием для хирургического получения сперматозоидов являются:
•    острые инфекционные заболевания любой локализации

Обследование перед хирургическим вмешательством для получения сперматозоидов:
•    определение группы крови и резус - фактора
•    клинический анализ крови, включая время свертываемости (действителен 1 месяц)
•    анализ крови на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С (действителен 3 месяца)

Осложнения при хирургическом получении сперматозоидов:
•    гематомы мошонки или интратестикулярные гематомы
•    инфицирование операционной раны

 








RETA
(rete testis aspiration)

PESA
(percutaneous epididymal sperm aspiration)


TESA
(testicular sperm aspiration)

SPAS
(spermatocele aspiration)


MESA
(microsurgical epididymal sperm aspiration)

TESE
(testicular sperm extraction)


Способы получения сперматозоидов при обструктивной азооспермии


Чрескожные аспирационные биопсии - являются оптимальным способом получения сперматозоидов при обструктивной азооспермии в цикле ИКСИ.
Недостатки:
•    отсутствие визуального контроля
•    невозможность получения большого объема ткани для морфологического исследования
Преимущества:
•    малая инвазивность
•    небольшая продолжительность
•    низкий риск осложнений
•    сохранение трудоспособности
•    мультифокальность

MESA
Выполняется при невозможности получения сперматозоидов при PESA и в ходе наложения вазоэпидидимоанастомоза. Снижает риск усугубления обструкции.
 
 


Способы получения сперматозоидов при необструктивной азооспермии.
Открытые биопсии являются оптимальными при необструктивной азооспермии.
Тактика при необструктивной азооспермии:
Мультифокальная микрохирургическая биопсия яичек с одномоментной криоконсервацией биоптата. В случае неудачи в цикле ИКСИ - оплодотворение ооцитов донорской спермой.

TESE

TESE – биопсия яичка, может выполняться при любом характере азооспермии при невозможности получения сперматозоидов иным путем.
•    Простая открытая биопсия яичка.
•    Открытая билатеральная микрохирургическая биопсия яичка.
•    Перкутанная биопсия яичка с использованием биопсийного пистолета
Открытая билатеральная мультифокальная биопсия яичек
Недостатком этой методики является сложность хирургической техники.
Достоинствами являются: контроль повреждения сосудов и кровотечения, контроль дефекта тестикулярной ткани. Билатеральный мультифокальный характер биопсии позволяет в 65% при необструктивной азооспермии получить сперматозоиды или сперматиды т.к. при необструктивной азооспермии может быть сохранен локальный сперматогенез.
Наиболее оптимальные точки мультифокальной биопсии яичка.

 

 
 


Динамическое наблюдение за пациентами после мультифокальной биопсии яичек.
После операции в яичках остаются гипоэхогенные зоны, которые через 6 месяцев проходят стадию организации и становятся гиперэхогенными у 50% пациентов, подвергаются полной регрессии у 14% и остаются без динамики у 36% пациентов.
До операции необходимо информировать пациентов о риске образования послеоперационных интратестикулярных гематом и атрофии яичек.
Необходимо предупредить пациентов об особенностях УЗ-картины после операции, т.к зоны операции могут ошибочно быть приняты за опухоль яичка.

TESA

TESA — аспирационная биопсия иглой большего диаметра. 
При этом всегда удается получить несколько участков паренхимы для анализа и/или экстракции.
Сопоставление результатов TESA и TESE у 14 больных (по данным Rosenlund B. et al., 1998) при биопсии иглой 19G - 100% совпадение, а иглой 21G - у 5 пациентов (37%) имело место расхождение.
Среднее количество семенных канальцев, полученных при TESA, в зависимости от размера биопсийной иглы Carpi A. et al (1999)
 
 


Результаты TESA и TESE при необструктивной азооспермии не зависят от:
•    уровня ФСГ (> 25 IU/ml)
•    степени атрофии яичка (V= 2 ml)
•    возраста
•    ультразвуковых параметров
•    результатов кариотипирования


Криоконсервация спермы

О сохранении подвижности сперматозоидов после их замораживания и оттаивания первым сообщил Спаланцани в 1776 году. Серьезная разработка методов криоконсервации началась в первой половине XX века. Существенный прогресс обеспечило применение первого криопротектора – глицерина, защищающего и сохраняющего функции сперматозоидов при замораживании.

Проблемы криоконсервации сперматозоидов.
Резкий перепад температуры в процессе замораживания изменяет агрегационные свойства вне- и внутриклеточной среды сперматозоидов, нарушая структуру и функции клеток. Дегидратация сперматозоидов сопровождается их сморщиванием, а образование внутри и снаружи кристаллов льда нарушает электролитный баланс и проницаемость клеточных мембран. Ледяные кристаллы вызывают повреждение внутриклеточных структур и гибель клеток.
Для преодоления этой проблемы используются:
1.    специальные  криопротекторные среды
2.    специальные программы заморозки/разморозки сперматозоидов

1. Используется среда из смеси яичного желтка с глюкозой или фруктозой или среда с сывороточным альбумином человека и глицерина с добавлением калликреина.
Эти среды препятствуют сморщиванию клеток, влияя на обмен ионов, и уменьшают образование кристаллов льда. Кроме того, эти среды связываются с мембранами клетки, стабилизируя ее.
2. Во избежание сморщивания клеток, осмотического их повреждения и образования ледяных кристаллов необходимо строго соблюдать соответствие темпов замораживания и оттаивания. Наружные кристаллы льда начинают образовываться вскоре после достижения 0С, а внутри клеток – при –15-18С.  По достижении –196С пробы хранят в жидком азоте. Скорость последующего оттаивания проб должна соответствовать скорости их замораживания.

Технологии криоконсервации.
После получения спермы она должна пройти стадию саморазжижения, наступающую после хранения при комнатной температуре. Это время может колебаться от 10 минут до 1 часа. Криоконсервант добавляется к разжиженной сперме в соотношении 1:1, после чего производится расфасовка спермы в соломки из полимера.



Для криоконсервации сперматозоидов используются специальные расходные материалы.
Прозрачные или цветные соломины со скользящей пробкой выпускаются двух типов - объемом 0,25 мл и 0,5 мл. Рабочий объем 0,21 мл или 0,47 мл. Запечатываются с помощью полимеризующегося порошка. Для заполнения рекомендуется использовать роликовый микроаспиратор Micro-Classic. Соломины стерилизованы гамма-излучением.      




Охлаждение спермы производится с помощью специальной аппаратуры. Для этого может быть использован универсальный охладитель программный КОП-6 и другие марки замораживателей биоматериалов.
Процесс криоконсервации требует, чтобы сперма была охлаждена до температуры - 196 градусов С т.е. температуры жидкого азота, который является лучшей средой для длительного хранения спермы. Соломки со спермой помещаются в горизонтальное положение в камеру охладителя. При замораживании сперма преодолевает два опасных температурных порога: около 0С и около - 20С. Поэтому для исключения вредного влияния температурных перепадов околонулевых температур, образцы спермы должны охлаждаться медленно, со скоростью 1 градус С в минуту. После достижения околонулевой температуры необходима экспозиция образца при данной температуре в течение 30-60 минут. Последнее условие необходимо для стабилизации подвижности сперматозоидов, что способствует повышению их криорезистентности.
Дальнейшее замораживание следует продолжать быстро - со скоростью не менее 20 градусов С в минуту до температуры около - 70 градусов С. После этого трубочки с образцами спермы должны быть перенесены в жидкий азот.

Другим методом криоконсервации спермы является метод криоконсервации с помощью сухого льда. Для данного метода не требуется сложного оборудования. После разжижения сперма смешивается в пробирке с криопротекторами в соотношении 1:1. Пробирка помещается в обычный холодильник на 2 часа. В течение этого времени происходит медленное падение температуры до + 4 градусов С.
В куске сухого льда формируются луночки диаметром около 1,0 см и глубиной до 0,5 см с помощью специальной формы, имеющей на поверхности выступы до 0,5 см и нагретой до температуры около 40 градусов С. В готовые лунки разливается охлажденная сперма. Затем замерзшие капли спермы переносятся (пересыпаются) в маркированные полимерные пробирки.
Показано, что хранение замороженных сперматозоидов более 36 месяцев приводит к снижению подвижности сперматозоидов. Однако зачатие и рождение детей наблюдалось при использовании сперматозоидов, хранившихся в замороженном состоянии до 9 лет.
Длительное время использование криоконсервированных сперматозоидов в процедуре ЭКО ограничивалось их параметрами после разморозки – подвижность не менее 10% клеток и концентрация не менее 10 млн/мл. С появлением технологий ИКСИ эти ограничения теряют значение.  

Показания к криоконсервации.

I. Кратковременная криоконсервация спермы.
•    Показана для накопления спермы при субфертильных ее показателях для последующего использования в программах внутриматочного оплодотворения или ЭКО.
•    Показана в случае отсутствия мужа в день проведении цикла вспомогательной репродуктивной программы.
II. Длительная криоконсервация спермы.

1.    Криоконсервация образцов, полученных при хирургических способах экстракции сперматозоидов из придатков или яичек избавляет пациентов от повторных операций по экстракции сперматозоидов, позволяет произвести больше попыток ЭКО или ИКСИ и предоставляет свободу в выборе времени проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения.

2.    Криоконсервация сперматозоидов сохраняет возможность продолжения рода для молодых лиц со злокачественными заболеваниями, такими как рак яичка, болезнь Ходжкина, лейкозы, опухоли костной ткани, которым планируется лучевая и/или химиотерапия. Криоконсервация сперматозоидов полезна и при любых других заболеваниях, лечение которых может сказаться на качестве спермы, особенно когда речь идет о химиотерапии, лучевой терапии или гормонотерапии.


3.    Криоконсервация сперматозоидов может быть гарантом возможности репродукции в профессиях, связанных с высоким риском для репродуктивного здоровья: при работе в условиях контакта с органическими и неорганическими веществами, при работе в условиях высоких и низких температур, ионизирующего излучения, при экстремальных видах работ (автогонщики, испытатели, военнослужащие в период военных действий).

4.    Криоконсервация сперматозоидов показана в случае мужской стерилизации (вазэктомии) т.к потребность в восстановлении фертильности составляет 3-5% от числа стерилизованных. Стоит напомнить, что вазэктомия – инвазивное вмешательство, часто приводящее к необратимому бесплодию.

5.    Криоконсервация сперматозоидов показана у пациентов с травмой спинного мозга или периферической полинейропатией у которых в 95% утрачивается способность к эякуляции. Электроэякуляция – психологически тягостная процедура, результаты которой можно и нужно использовать для криоконсервации для последующих программ экстракорпорального оплодотворения.

6.    Криоконсервация спермы доноров – это единственная возможность использования спермы доноров по действующим нормативным законодательным актам нашего государства. Донорскую сперму можно использовать только через шесть месяцев после ее забора, в течение которых проводится двукратное обследование донора спермы на наличие инфицированности вирусами иммунодефицита человека, гепатита В и С, обеспечивают защиту реципиента от передачи со спермой донора инфекций TORCH комплекса.
Накопление донорских сперматозоидов позволяет предоставить реципиентам больший выбор материала, различного по генотипу и фенотипу. Медицинское обследование доноров спермы проводится согласно рекомендациям Российской Ассоциации Репродукции Человека и Американского Общества Репродуктивной Медицины, включающим скрининг на различные инфекции, медико-генетическое обследование.